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關鍵字:超聲波細胞破碎儀、粘度計、金屬浴、組織研磨儀

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技術知識

細胞破碎技術簡述-超聲波破碎和高壓均質技術應用

文章出處:原創 作者:Lawson(洛尚中國) 人氣: 1711 發表時間:2019/4/13 10:16:27


細胞破碎,細胞破碎技術是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁,使細胞內容物包括目的產物成分釋放出來的技術。細胞破碎分離提純某一種蛋白質時,首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態,不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織,其細胞破碎的難易不一,使用的方法也不相同,如動物臟器的細胞膜較脆弱,容易破碎,植物和微生物由于具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁。


1. 簡介

2. 原理與技術

3. 空穴效應

4. 撞擊效應

5. 剪切效應

6.  應用介紹

 6.1.? 細胞破碎(大腸桿菌,酵母菌,細菌等)

 6.2.? 保持細胞活性

 6.3.? 細菌

 6.4.? 酵母菌

 6.5.? 真菌

 6.6? 植物細胞

7.  細胞破碎技術及常用方法

 7.1.  機械法

 7.2.非機械法


簡介

細胞破碎技術是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁,使細胞內容物包括目的產物成分釋放出來的技術,是分離純化細胞內合成的非分泌型生化物質(產品)的基礎。 結合重組DNA技術和組織培養技術上的重大進展,蛋白質可以大規模生產。


? 原理與技術

超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發射的15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。 超聲波振蕩器有不同的類型,常用的為電聲型,它是由發生器和換能器組成,發生器能產生高頻電流,換能器的作用是把電磁振蕩轉換成機械振動。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質兩種型式。

高壓均質機是由一個高壓柱塞泵及特殊結構的均質閥組成,需處理的物料在柱塞所造成的高壓條件下進入可調節壓力大小的閥組中,失壓后的物料從可調節限流縫隙中以極高的流速(1000米/秒,最高可達1500米/秒)噴出,撞在閥組件之一的沖擊環上。


空穴效應

被柱塞壓縮的物料內積聚了極高的能量,通過可調節限流縫隙時瞬間失壓,造成高能釋放引起空穴爆炸,致使物料強烈粉碎細化。(主要應用于均質)

撞擊效應

通過可調節限流縫隙的物料以上述極高的速度,撞擊到用特殊材料制成的的沖擊環上,造成物料粉碎。(主要應用于細胞破碎)

剪切效應

高速物料通過泵腔內通道和閥口狹縫時會產生剪切效應。被三種效應處理過的物料可均勻細化到0.03μm-2μm粒徑。(主要應用于乳化)


應用介紹

細胞破碎(大腸桿菌,酵母菌,細菌等)

利用大腸桿菌、酵母等菌種進行發酵,然后經過破壁后提取細胞內酶、蛋白質等活性的產物是生物工程中的重要技術。而這些工藝中很重要的一步就是細胞破碎。

保持細胞活性

保持細胞活性的最重要參數是溫度和時間,物料在高壓均質閥內部的約0.01秒的瞬間,在高壓的作用下溫度會上升到大約10~15℃。

通過均質閥后在經過高效換熱器的作用下,溫度在2~3秒作用會迅速下降,所以物料在溫度相對較高的條件下僅僅維持最多3秒鐘。

細菌

幾乎所有細菌的細胞壁都是由肽聚糖(peptidoglycan)組成,它是難溶性的聚糖鏈(glycan chain),借助短肽交聯而成的網狀結構,包圍在細胞周圍,使細胞具有一定的形狀和強度。短肽一般由四或五個胺基酸組成,如L-丙氨醯-D-谷氨醯-L-賴氨醯-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-胺基酸與二氨基庚二酸存在。 破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網狀結構,其網結構的致密程度和強度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數量和其交聯的程度,如果交聯程度大。

酵母菌

酵母細胞壁的最里層是由葡聚糖的細纖維組成,它構成了細胞壁的剛性骨架,使細胞具有一定的形狀,覆蓋在細纖維上面的是一層糖蛋白,最外層是甘露聚糖,由1,6一磷酸二酯鍵共價連接,形成網狀結構。在該層的內部,有甘露聚糖-酶的復合物,它可以共價連接到網狀結構上,也可以不連接。與細菌細胞壁一樣,破碎酵母細胞壁的阻力主要決定于壁結構交聯的緊密程度和它的厚度。

真菌

霉菌的細胞壁主要存在三種聚合物,葡聚糖(主要以β-1,3糖苷鍵連接,某些以β-1,6糖苷鍵連接),幾丁質(以微纖維狀態存在)以及糖蛋白。最外層是α-和β-葡聚糖的混合物,第2層是糖蛋白的網狀結構,葡聚糖與糖蛋白結合起來,第3層主要是蛋白質,最內層主要是幾丁質,幾丁質的微纖維嵌入蛋白質結構中。與酵母和細菌的細胞壁一樣,真菌細胞壁的強度和聚合物的網狀結構有關,不僅如此,它還含有幾丁質或纖維素的纖維狀結構,所以強度有所提高。

植物細胞

對于已生長結束的植物細胞壁可分為初生壁和次生壁兩部分。 初生壁是細胞生長期形成的。 次生壁是細胞停止生長后,在初生壁內部形成的結構。 較流行的初生細胞壁結構是由Lampert等人提出的“經緯”模型,依據這一模型,纖維素的微纖絲以平行于細胞壁平面的方向一層一層敷著在上面,同一層次上的微纖絲平行排列,而不同層次上則排列方向不同,互成一定角度,形成獨立的網路,構成了細胞壁的“經”,模型中的“緯”是結構蛋白(富含羥脯氨酸的蛋白),它由細胞質分泌,垂直于細胞壁平面排列,并由異二酪氨酸交聯成結構蛋白網,徑向的微纖絲網和緯向的結構蛋白網之間又相互交聯,構成更復雜的網路系統。半纖維素和果膠等膠體則填充在網路之中,從而使整個細胞壁既具有剛性又具有彈性。 在次生壁中,纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多,纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規則。因此次生壁的形成提高了細胞壁的堅硬性,使植物細胞具有很高的機械強度。


細胞破碎技術

破碎方法可規納為機械法和非機械法兩大類。


機械法

?高壓勻漿破碎法(homogenization)

高壓勻漿器是常用的設備,它由可產生高壓的正向排代泵(positive displacenemt pump)和排出閥(discharge valve)組成,排出閥具有狹窄的小孔,其大小可以調節。細胞漿液通過止逆閥進入泵體內,在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速沖出,并射向撞擊環上,由于突然減壓和高速沖擊,使細胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上,可以采用單次通過勻漿器或多次循環通過等方式,也可連續操作。為了控制溫度的升高,可在進口處用干冰調節溫度,使出口溫度調節在20℃左右。在工業規模的細胞破碎中,對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細胞。

?振蕩珠擊破碎法 (Skaking Bead)

將等體積的小量組織樣品與高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋蓋微量管中,再加入緩沖液與穩定成份到1.5ml的體積,用6500RPM振湯機高速上下振動8秒,休息8秒,再振動8秒即可。此方法是目前最快且一次可處理最多樣品的方法。 一臺機器最多可以在一天處理2400支樣品。對小量且多樣的人很方便。

?高速攪拌珠研磨破碎法(fine grinding)

研磨是常用的一種方法,它將細胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌,使細胞獲得破碎。在工業規模的破碎中,常采用高速珠磨機 。

?超聲波破碎法(ultrasonication)

超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發射的15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。 超聲波振蕩器有不同的類型,常用的為電聲型,它是由發生器和換能器組成,發生器能產生高頻電流,換能器的作用是把電磁振蕩轉換成機械振動。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質兩種型式。


非機械法

?滲透壓沖擊破碎法(osmotic shock)

滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法,將細胞放在高滲透壓的溶液中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液),由于滲透壓的作用,細胞內水分便向外滲出,細胞發生收縮,當達到平衡后,將介質快速稀釋,或將細胞轉入水或緩沖液中,由于滲透壓的突然變化,胞外的水迅速滲入胞內,引起細胞快速膨脹而破裂。

?凍融破碎法(freezing and thawing)

將細胞放在低溫下冷凍(約-15℃),然后在室溫中融化,反覆多次而達到破壁作用。由于冷凍,一方面能使細胞膜的疏水鍵結構破裂,從而增加細胞的親水性能,另一方面胞內水結晶,形成冰晶粒,引起細胞膨脹而破裂。對于細胞壁較脆弱的菌體,可采用此法。

?酶溶破碎法(enzyme lysis)

酶解是利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞,使細胞壁受到部分或完全破壞后,再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜,進一步增大胞內產物的通透性。溶菌酶(lysozyme)適用于革蘭氏陽性菌細胞的分解,應用于革蘭氏陰性菌時,需輔以EDTA使之更有效地作用于細胞壁。 真核細胞的細胞壁不同于原核細胞,需采用不同的酶。

?化學破碎法(chemical treatment)

采用化學法處理可以溶解細胞或抽提胞內組分。常用酸、堿、表面活性劑和有機溶劑等化學試劑。

?去垢劑破碎法(detergents)


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