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關鍵字:超聲波細胞破碎儀、粘度計、金屬浴、組織研磨儀

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破碎細胞遇到的常見問題

文章出處:原創 作者:Lawson(洛尚中國) 人氣: 313 發表時間:2018/6/18 10:52:06

1. 大腸桿菌表達外源蛋白,在超聲破碎的時候,用含有1%triton-X-100的PBS懸浮,然后超聲的效果較好,1%triton-X-100的作用還是很明顯的,對其他的一些細菌同樣起作用,比如鏈霉菌。在表達重組蛋白后用超聲波細胞破碎儀破碎細胞,采用冰浴,400w,破碎2s停1s,但是不一會就產生大量泡沫,影響了破碎功率,pbs和tris緩沖液都是這樣,zui后都是破碎不完全,而目的蛋白就在這些未破碎的細胞中,怎么辦?

解析:會產生氣泡是因為探頭位置沒放好;探頭一定要接近底部,約0.5-1cm;功率根據儀器不同會有所不同,但可以觀察液面,有波動但不要太劇烈;可以選擇超聲波細胞破碎儀破碎3s停10s,破碎20-30次;變幅桿位置擺放也要注意,聽聲音如果不對的話就要及時調整;從菌濃度方面考慮。在破碎時試著加大體積,強度zui好不要超過60%;嘗試破碎8s停8s,對有些菌體蛋白來說,難散熱導致蛋白變性產生氣泡,可以停頓時間稍長一些,這種情況多見于包涵體形式的蛋白。

2. 鏈霉菌(放線菌)超聲破碎條件是什么?

解析:放線菌屬于原核生物系統進化樹上的(G+C)摩爾百分含量(mol%)高的革蘭氏陽性菌(Eubacteria)分枝類群,它雖然具有原核生物特有的分子生物學特性,但在其不同類群中,細胞壁的化學組分變化很大。在做大腸桿菌超聲時,采用的是400W,破碎5s停5s的方法,效果不錯,但是用在鏈霉菌上,由于細胞壁組成差異一般沒什么效果。 鏈霉菌(放線菌)超聲破碎前處理一般是配置成一定濃度的菌懸液。使用超聲波細胞破碎儀破碎時采用的具體條件是:取細菌的24 h培養液于5 000 r/min 下離心5 min收集菌體;用pH 7.5的Na2HPO -NaH2PO 緩沖液洗滌3次,再用該緩沖液將菌體配成1:3的菌懸液。置于40 mL大塑料試管內;將大塑料試管置于冰浴中,采用超聲波細胞破碎儀破碎(功率200W,1/2”探頭,破碎30s,間歇30s);破碎液于12 000 r/min下高速冷凍離心30 min,收集細胞碎片和上清夜。洗滌菌體也可以用預冷的生理鹽水或pH8的Tris-HCl,洗滌一次就可以。另外,超聲劑量隨樣品量、菌體改變比較大,功率可以到400-600w,破碎5s,停5s,冰浴,要加終濃度1 mM的PMSF。為確定合適的超聲強度和次數,有必要隨時鏡檢觀察菌體是否完全破碎。


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